ALGUNOS CRITERIOS PARA EL DIAGNOSTICO DE PARASITOS 

Regla de oro en Parasitología: recobrar, identificar y demostrar el parásito, para poder determinar la etiología del proceso de infección o enfermedad.

1. Métodos directos:   Identificar parásitos o sus productos de reproducción
2. Métodos indirectos:   Obtener con pruebas serológicas y de otro tipo resultados que, unido a la clínica y a otras consideraciones, dan un diagnóstico probable.

Solicitud de exámenes (situación clínica) dependerá:

• Tipo de población servida
•  Personal técnico disponible
• Metodología disponible
• Costos
•  Relevancia clínica de los resultados

 Base indispensable de conocimiento para solicitud de exámenes:

•  Ciclo de vida de los parásitos locales
• Habitat en el hospedero, usual y ectópica
• Manifestaciones clínicas más específicas o probable 
• Maneras de transmisiónEjemplos de muestra a enviar al laboratorio para demostrar parásitos en general:Heces
• Sangre

• Orina - Secreciones
• Esputo - Excreciones
•  Pus - Otros líquidos
•  LCR – Parásito in toto

Biopsia de tejidos – Aspirados

Ejemplos:

1.  Heces:  este examen puede demostrar parásitos localizados en:

 Localización y Ejemplo:

•  Intestinos: Ascaris, Trichuris
•  Hígado: Fasciola hepática
•  Sangre: Trypanosoma cruzi,
• Malaria: Pulmones especies de Paragonimus

Aspirado duodenal

Examen útil para demostrar:

• Parásito: Estadio
•  Cryptospon'dium sp:  ooquiste
•  Isospora belli: ooquiste
• Giardia lamblia: trofozoíto, quiste
• Strongyloides stercoralis: larva

MÉTODOS DIRECTOS,

ejemplos:

•  Baermann : extrae larvas.
•  Flotación de Sheather:  concentra ooquistes de algunos apicomplexa
•  Raspado de úlcera perineal : demuestra trofozoítos de Entamoeba histolytica
• enamebiasis cutís: Raspado de úlcera cutánea - evidencia amastigotes de Leishmania
•  Lavado bronquial: demuestra estadios de Pneumocystis carinii en algunas situaciones de inmunocompromiso.

MÉTODOS INDIRECTOS,

 ejemplos:

•  Inmunológicos:  hemaglutinación indirecta para tripanosomiasis americana
•  Inmunohistoquímicos:  microsporidiosis- Rayos X - de abdomen para visualizar cambios en diagnostico de angiostrongilosis abdominal
•  "Pornografía axial computarizada:  neurocisticercosis
• Resonancia magnética: absceso hepático amebiano
• Péptidos sintéticos, otra tecnología biomolecular: diferenciar Trypanosoma cruzi deT. rangeli

METODOS PARA EL DIAGNOSTICO DE PARASITOS INTESTINALES LUMINALES & TISULARES

  EXAMEN DIRECTO EN SOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA Y EN SOLUCIÓN DE LUGOL

PROPÓSITO:

•  En solución salina fisiológica:

 Reconocer trofozoítos de protozoos y otros estadios de diagnóstico de helmintos y protozoos y elementos que aparecen en situaciones anormales. El mejor método para detectar trofozoítos en una amebiasis invasora por Entamoeba histolityca. Para ejecutar cuenta de huevos de algunos helmintos para estimar intensidad de la infección.

•  En solución de Lugol:

 Colorear en forma temporal trofozoítos y quistes de protozoos. Inmovilizar larvas.

CUENTA DE HUEVOS DE NEMÁTODOS TRANSMITIDOS POR EL SUELO.

PROPÓSITO:

Estimar la intensidad de una infección intestinal por Ascarís lumbricoides, Trichuris trichiura  y uncinarias del humano en forma práctica, en una cantidad conocida de heces. Evaluar la efectividad de tratamiento terapéutico. Se asume que la producción de huevosestará en relación directa con el número de hembras fecundas que deponen huevos. Una variable importante es el propósito para determinar esta intensidad: puede ser clínica, para encuestas, evaluar terapéutica, etc.

 MÉTODOS:

 Los más utilizados son tres (3):

• método directo: en frote (2 mg) de heces;
• método de concentración por kato, variación katz: en 41.7 mg de heces;
• cuenta directo de gusanos adultos expulsados después del tratamiento, el cual es más preciso si el tratamiento es efectivo y si se cumplenlas instrucciones. Método de dilución de stoll: en 1g de heces; no se ha estandarizado y ya no se usa

1. METODO DIRECTO EN FROTE DE HECES

PRINCIPIO: 

Este método es una simplificación del método estándar de Beaver en 2 mg de heces en el que se utiliza una célula foto-eléctrica adaptada y calibrada que mide con precisión2 mg de heces en una preparación en solución salina. La simplificación deriva del conocimiento que las preparaciones directas que se utilizan en la rutina para el examen de heces contienen entre 1.5 mg y 2.5 mg especialmente las preparadas por técnicos con experiencia.

 MUESTRA REQUERIDA:

Heces frescas, recolectadas en frasco (vidrio, plástico o cartón) limpio, de boca ancha,sin contaminación de agua, orina, tierra etc.

MATERIALES:

•  Porta-objetos de 3 X 1 pulgada (7,5 x 2.5 cm) ó 3 X 2 pulgadas 7.5 x 5cm)
•  Cubre-objetos de 22 X 22 mm, #1 ó #2
•  Aplicadores de madera
•  Solución salina fisiológica (0.85%)
•  Marcador
•  Contador manual
•  Frasco con solución desinfectante para descartar material

 PROCEDIMIENTO:

• Identificar el porta-objetos con la muestra de heces a examinar 
• Colocar 1 - 2 gotas de solución salina en cada extremo del porta-objetos
•  Con un aplicador, tomar una porción de heces y emulsificaren cada una de las gotas de solución salina
• Cubrir cada preparación con un cubre-objetos
• Contar en forma individual los huevos según la especie: de Ascaris, Trichuris y/o uncinaria presentes en cada preparación. Sacar la media
• Informar por especie de parásito: No. de huevos/frote de heces o bien No. de huevos/2 mg de heces
• Descartar material usado en el frasco con desinfectante.

CAUSAS DE ERROR:

• Preparación muy gruesa o muy fina
•  Observación no sistemática de la preparación
•  Falta de práctica en ejecutar conteos. 
• Huevos no distribuidos al azar en la preparación, o aglomerados por la presencia demucho moco. 
• Heces líquidas

 2. MÉTODO DE KATO (VARIACIÓN KATZ)

                                                                

PRINCIPIO:

Aclarar con glicerina un frote grueso de heces no diluidas. El método, originalmente introducido por japoneses para hacer encuestas epidemiológicas de schistosomiasis, hasido mejorado y modificado varias veces.

La variación KATZ entrega una cantidad conocida de heces, que depende del tamaño del templete utilizado, con la condición quesean heces formadas. El tamaño del templetevaria; para asegurar resultados comparables, el templete debe estandarizarse en el país auna sola medida. El que se describe aquí entrega 41.7 mg de heces. Huevos de Taenia  sp o de Hymenolepis nana  se informan sin contar. La Organización Mundial de la Salud considera este método como el de elección y el más adecuado en encuestas, monitoreo y evaluación de programas de control de nemátodos transmitidos por el suelo y schistosomiasis.

 VENTAJAS:

Las heces no se diluyen, se utiliza materiales baratos y accesibles, puede transportarse una vez preparado en el campo, puede guardarse varios meses para verificar resultados, puede estandarizarse para encuestas en diferentes regiones geográficas por diferentes investigadores.

DESVENTAJAS:

Tiene varias limitantes: sólo puede utilizar heces frescas; no es adecuada para heces diarreicas, líquidas o mucoides; no se aplica para la detección de protozoos ni larvas de nemátodos; huevos frágiles como los de uncinaria y a menudo de Hymenolepis nana se vuelven irreconocibles en pocas horas; no es indicado para heces que contengan mucha fibra o grasa.

MATERIALES:

• Cuadrados de celofán que miden 22 X 30 mm. Sumergir durante 24 horas o más enla solución de glicerina
• Espátulas plásticas de madera o palos de paletas o de helados
•  Templete de plástico del tamaño seleccionado, en este caso de 6 mm de diámetro X 1.5 mm de grosor
•  Cuadrados de 4 cm X lado de tela metálica o nylon de trama 210 o de nitrel de 250/rni
•  Papel absorbente
•  Papel de periódico
•  Pinzas
•  Frasco con desinfectante para descartar material
•  Porta-objetos 7.2 x 2.5 cm (3 X 1 pulgada) ó 7.5 x 5 cm (3 X 2 pulgadas)
•  Marcador
•  Baja-lenguas o palo de paleta o de helados, que es más barato
• Contador manual

PROCEDIMIENTO:

•  Extender el papel periódico o de estraza sobre la mesa de trabajo
•  Identificar el porta-objetos con la muestra a examinar. Colocar sobre éste el templete de plástico
•  Con el palo de paleta tomar una cantidad de heces y colocarla sobre una superficie plana (tapadera del frasco, papel periódico)
•  Colocar sobre estas heces un cuadrado de tela metálica, plástica o nylon que hace las veces de colador
•  Raspar la superficie de la tela con el espátula plástica tomando suficientes heces coladas para llenar el agujero del templete. Descartar el espátula si es de madera
• Remover el templete, descartar éste y la tela en desinfectante y cubrir el redondel de heces con un cuadrado de celofán empapado en glicerina
• Invertir el porta-objetos con esta preparación sobre una hoja de papel absorbente y hacer presión con el pulgar hasta extender las heces por todo el cuadrado  
• Darle vuelta y colocar sobre una superficie protegida de insectos (mosca, cucaracha) yagua. Esperar que aclare. Esto dependerá de la temperatura y humedad del ambiente, entre 30 miny45 min. Si se desea interrumpir el aclaramiento, invertirla lámina sobre una superficie plana lo necesario hasta continuar el proceso.
• Observar al microscopio óptico con objetivo de 10 X

3. RECOBRAR Y CONTAR PARÁSITOS ADULTOS 

EXPULSADOSDESPUÉS DE TRATAMIENTO

PRINCIPIO:

Recobrar los gusanos adultos, hembras y machos presentes en una infección intestinalpara determinar la intensidad de la infección, o para comprobar la efectividad de unantihelmíntico. Se requiere la colaboración fiel del (los) participante(s) durante todo eltiempo que dure la recolección y contar con un antihelmíntico efectivo.

PROCEDIMIENTO:

•   Informar al personal (de hospital si es clínico; al voluntario si es de encuestas) paraque colecte heces de 24 horas durante 4-5 días después de iniciado el tratamiento.La forma de hacerlo dependerá de los recursos e ingenio de cada investigador.
• Lavar diariamente y por separado las heces de 24 horas recogidas en bolsas plásticascon el nombre de cada individuo, utilizando pascones o un tamiz y bandejasesmeriladas o de acero inoxidable y recobrar los parásitos de este lavado. Ayudarsecon pinceles finos para recoger los parásitos más pequeños.
•  En caso de Ascaris lumbricoides: Medirlos, secarlos y pesarlos (opcional); fijarlos con formalina caliente al 5%, enfrascos apropiados.  
•   En caso de Trichuris trichiura y uncinarias: Contarlos y separarlos por sexo si se desea y fijarlos. Beaver et al comentan que gusanos pequeños se estiran en ácido acético glacial, se lavan y se fijan, guardándolosen alcohol etílico al 70% con 5% de glicerol. Otro fijador que da buenos resultadospara todo tipo de gusanos es una mezcla a partes iguales de formalina al 10% yalcohol etílico de 95%, al que se agrega 5% de ácido acético (5 partes de ácidoacético y 95 partes de formalina-alcohol).
• En situación de campo, los datos iniciales del estimado de la intensidad de la infecciónpor cuenta de huevos más la cuenta de adultos proveerá datos epidemiológicos máscorrectos que documenten la relación entre la cuenta de huevos y el número degusanos adultos. Esta carga parasitaria variará según las diferentes regiones del país,las distintas condiciones epidemiológicas y condiciones de la población.

4. MÉTODO DE DILUCIÓN DE STOLL

 PRINCIPIO:

La cantidad de heces es medida por desplazamiento; al final del proceso se cuentan los huevos en una alícuota de la dilución. El diluyente, hidróxido de sodio, saponifica la grasa de las heces y ayuda a liberar los huevos de impurezas.

 La mayor desventaja es el equipo que requiere y el tiempo de preparación. Impráctico en encuestas. No se ha estandarizado y ha caído en desuso.

MATERIALES:

• Frasco de Stoll, marcado 2 veces: a 56 mL de volumen y a 60 mL de volumen; en su defecto, probeta graduada con tapón de hule, que tenga las dos marcas, a 56 mL y a 60 mL.
•  Solución de hidróxido de sodio
•  Pipetas graduadas a 0.15 mL (dispensador automático para serología)
•  Porta-objetos
• Cubre-objetos 22 X 40 mm
•  Aplicadores de madera
•  Frascos con desinfectante para descartar material
•  Perlas de vidrio
•  Contador manual
•  Marcador
•  Frascos con desinfectante para descartar material sucio.

 PROCEDIMIENTO:

•  Identificar el frasco de Stoll con la muestra a examinar
•   Añadir hidróxido de sodio hasta la marca 56 mL en el frasco para ello
•  Con cuidado agregar heces hasta subir el nivel del líquido a la marca 60 mL
•  Agregar las perlas de vidrio, tapar y agitar vigorosamente. Si las heces son muy duras, deberá dejarse 24 horas agitando esporádicamente
•  Con la pipeta Stoll remover 0.15 mL del centro de la suspensión inmediatamente después de agitar y antes que los huevos comiencen a sedimentarse
• Colocar ésta suspensión sobre un porta-objetos y cubrir con un cubre-objetos
•  Contar todos los huevos presentes en toda la preparación. Multiplicar el resultado por 100 y reportar No. de huevos/g o No. de huevos/ mi de heces, sin factor de corrección
• Para reportar con factor de corrección, debe considerarse la consistencia de las heces y multiplicar por 2 para heces blandas; por 3 para heces diarreicas. Cuentas en  heces líquidas no son confiables.

5. MÉTODO DE LA CINTA TRANSPARENTE ADHESIVA

 PROPÓSITO:

Recobrar huevos de Taenia sp. o de Enterobius  vermicularis de la región anal y perianal de individuos infectados. Hembras de E. vermicularis migran del ciego e intestino grueso a la región exterior del ano, adonde depositan huevos casi infectantes, razón por la cual casi nunca se ven en las heces. Los proglótidos grávidos de Taenia saginata  y aveces de T. solium  que se desprenden de la estróbila y forzan el esfínter anal, dejan rastros de huevos en la región perianal mientras tienen movimientos de extensión o retracción. Para diagnosticar infecciones por E. vermicularis, la cinta transparente adhesiva es el método indicado; para identificar individuos infectados con Taenia sp. este método, en combinación con otros métodos y la observación clínica, aumenta la probabilidad de diagnóstico

PREPARACIÓN DEL PACIENTE:

La toma de esta muestra es fácil de realizar aún por personas de poca preparación o analfabetas, siempre que se provea una explicación clara y sencilla. Para este o cualquier otro método que se utilice, la muestra debe tomarse antes que el paciente se lave, bañe o defeque, durante la noche o inmediatamente al levantarse por la mañana (F. vermicularis)  o en cualquier momento (Taenia) antes del examen.

NOTA: En ocasiones se pueden ver los gusanos adultos al separar los glúteos o sobrelas heces a! defecar. Si esto sucede, deberán llevarse al laboratorio para la confirmación morfológica. Como instrucción a la madre, se le indica de recogerlos y colocarlos en alcohol o vinagre en un bote limpio y llevarlos al laboratorio.

 MATERIALES:

•  Porta-objetos
• Baja-lenguas o palo de paleta
•  Cinta transparente adhesiva de 2 cm de ancho
•  Xilol
•  Etiquetas
•  Pipeta Pasteur y bulbo o perilla de goma
•  Frasco con desinfectante para descartar material

PROCEDIMIENTO:

• Colocar una tira de cinta transparente adhesiva sobre un porta-objetos limpio y seco, dejando un extremo doblado por debajo de la lámina y en el otro pegar una etiquetay escribir la identificación del paciente
•  Al momento de tomar la muestra, pelar la cinta suavemente del porta-objetos,tomándola por la parte etiquetada.
• Colocar el porta-objetos sobre un baja-lenguas o palo de paleta y doblar la cintasobre un extremo de éste, con la parte adhesiva hacia fuera
• Con el paciente en decúbito, apartar los glúteos con una mano y apretar la cinta adhesiva firmemente a un lado y otro de los pliegues perianales
• Volver a colocar la cinta sobre el porta-objetos y descartar el baja-lenguas.La muestra 
• puede transportarse o guardarse protegida, hasta el momento del examen.
• Para examinar, desprender la cinta transparente hasta la parte expuesta, agregar 1-2 gotas de xilol a la lámina y apretar de nuevo la cinta en su lugar. El xilol (puede ser tolueno) aclara la preparación, elimina las burbujas de aire y hace más visibles los huevos. 
• Examinar inmediatamente al microscopio.

6. MÉTODO DE FLOTACIÓN POR SULFATO DE ZINC

PROPÓSITO:

Concentrar huevos de ciertos helmintos y quistes de protozoos cuando las infecciones son muy leves y no se detectan en preparaciones directas.

 MUESTRA REQUERIDA:

 Heces frescas recolectadas en frasco {vidrio, plástico o cartón) de boca ancha, con tapadera, limpio, sin contaminantes (agua del inodoro, orina, tierra etc.) debidamente identificado.

PREPARACIÓN DEL REACTIVO:

Disolver 330 g de cristales de sulfato de zinc en 670 mL de agua destilada. Para verificar la densidad, verter dentro de un cilindro de 1,000 mL de capacidad e introducir el hidrómetro, dejándolo flotar libremente, sin tocar las paredes del cilindro. Debe leerse 1.18. Agregar más agua si está más denso, o más cristales si está menos denso. Se recomienda verificar la densidad cada vez antes de usar o una vez por semana. Cuando la muestra de heces fue fijada, usar una solución con densidad 1.20.

MATERIALES:

•  Hidrómetro (Curtis Matheson Scientific Inc) para medir gravedad especifica, rango 1,000-2,000)
•  Solución de sulfato de zinc, densidad 1.18 (para heces frescas)
•  Cuadrados de gasa de 16 X 16 cm, en 2 dobleces
•  Embudos de 5 cm de diámetro
•  Aplicadores
• Tubos de ensayo, vasos de papel o vasos plásticos pequeños para hacer una suspensión de heces
•  Porta objetos,
• Cubre-objetos 22 X 22 mm, No. 1 ó No. 2
•  Solución de Lugol
•  Asa bacteriológica de 5-7 mm de diámetro
•  Gradilla para tubos
•  Solución salina fisiológica

 PROCEDIMIENTO:

•  Identificar la muestra con el vaso y el tubo de ensayo a trabajar.
•  Con un aplicador, tomar 1-1.5 g de heces y hacer una suspensión en unos pocos ml_ de agua destilada* en un vaso o tubo.
•  Filtrar a través de gasa humedecida a un tubo de ensayo. Centrifugar a 1,500-2,000 rpm por 2 minutos. Descartar el sobrenadante.
•  Agregar 2-3 mL de solución de sulfato de zinc y agitar con un aplicador hasta suspender totalmente el sedimento. Agregar más solución de sulfato de zinc hasta 1cm abajo del borde del tubo de ensayo, sin dejar de agitar.
• Centrifugar a 2,000 por 2 minutos. Los tubos deben tener posición vertical en la centrífuga, no inclinada.
•  Sin sacar el tubo de la centrifuga, remover varias asadas de la película superficial y colocarlas sobre un porta-objetos. Esterilizar el asa por flameo.
• Cubrir con un cubre-objetos. Examinar sistemáticamente la preparación. Para colorear los quistes, remover con cuidado el cubre-objetos y añadir una gota pequeña de Lugol.
• Para identificar los quistes se procede a examinarlos con el objetivo X100, para lo cual debe colocarse antes una pequeña gota de aceite sobre el cubre-objetos.
• Puede ejecutarse este método cuando se reciben heces fijadas, para lo cual la solución de sulfato de zinc debe tener una densidad de 1.20. Para trabajar la muestra, mezclar bien las heces fijadas, filtrar si necesario y continuar con el procedimiento como se ha descrito.

CAUSAS DE ERROR O RESULTADOS POCO SATISFACTORIOS:

•  En general, si no se sigue el método fielmente -Solución de sulfato de zinc de otra gravedad específica
• Esperar mucho tiempo después de preparar la muestra, antes de observarla al microscopio (más de 20 minutos)
•  Deformación de los quistes de protozoos, que dificulta su identificación- A veces no flotan los huevos infértiles de Ascaris - No es el método adecuado para huevos de céstodos ni de tremátodos Las larvas se encogen y no se puede reconocer su morfología específica

7. CONCENTRACIÓN POR FORMALINA - ACETATO DE 

ETILO

PROPÓSITO:

Concentrar huevos y larvas de helmintos y ooquistes y quistes de protozoos de lasheces. Se recurre a este método cuando el examen directo es negativo, cuando la excreciónde quistes/ooquistes es baja e intermitente o para descartar infecciones leves en general,sobre todo si otros métodos (sulfato de zinc por Ej.) no han ofrecido resultados esperados.El método original utilizaba éter, pero esta sustancia se ha sustituido por acetato de etilopor ser menos inflamable y explosiva que el éter. Algunos sugieren centrifugar por 10minutos en vez de dos minutos para recobrar ooquistes de apicomplexa, pero encontramosque se forma demasiado sedimento que impide realizar el examen parasitológico

VENTAJAS:

Puede utilizarse con heces frescas o heces fijadas previamente en formalina o en MIF;los quistes de protozoos no se deforman; puede demorarse en examinar el sedimentomás que en métodos por flotación; es adecuado tanto para huevos de nemátodos comode céstodos y tremátodos; produce menos errores técnicos que otras concentraciones.

 DESVENTAJAS:

 Los huevos infértiles de Ascarís y en ocasiones quistes de Giardia pueden flotar y descartarse inadvertidamente con el tapón de detritus; utiliza tubos de ensayo de vidrio(cuando se usa éter), ya que los tubos de plástico son dañados por éste; no es adecuado para concentrar trofozoítos de protozoos.

 MUESTRA A EXAMINAR:

 Heces frescas recolectadas en frasco limpio y seco, de boca ancha, identificado correctamente.

MATERIALES:

• Vasitos de plástico o cartón (30 m!_ de capacidad)
•  Tubos de centrífuga de ensayo 13 X 100 mm
•  Aplicadores
•  Marcadores
• Embudos de 5 cm de diámetro
•  Gasa quirúrgica en rectángulos de 16 X 16 cm en 2 dobleces
•  Parafilm o tapones de hule
•  Solución de formalina al 10%
•  Acetato de etilo
•  Aplicadores con algodón en un extremo-Porta-objetos de 7.5 X 2.5 cm (3 X 1 pulgada) o de 7.5 X 5 cm (3 X 2 pulgadas)
•  Cubre-objetos-Gradilla para tubos-Pipeta graduada de 5 mL-Balanza de 2 platos para equilibrar tubos
•  Solución de Lugol
•  Acetato de etilo
•  Frascos con desinfectante para descartar material

PROCEDIMIENTO: 

• Identificar frascos, tubos y láminas con la muestra a examinar.
•  Transferir 1-2 g de heces a un vaso de plástico o cartón y agregar 10 mL de formalina.-Desmenuzar y suspender completamente las heces con ayuda de aplicadores.-Descartar aplicadores. Dejar fijar mínimo 30 minutos.
•  Filtrar por 2 dobleces de gasa a un tubo cónico o de ensayo ayudado por embudo.Descartar gasa. Tapar tubos-Equilibrar los tubos en balanza de 2 platos junto con los tapones.-Centrifugara 1,500 rpm por 2 minutos; destapar.-Descartar el sobrenadante.
•  Agregar más formalina al sedimento, agitando éste con un aplicador, hasta ± lamitad del tubo.
•  Agregar 2-.3 mL de acetato de etilo.
•  Tapar el tubo con para film o tapón de hule y agitar vigorosamente 15 segundos.
• Centrifugara 1,500 rpm por 2 minutos.-Al final de la centrifugación se obtienen 4 capas Sedimento, formalina, tapón de detritus y acetato de etilo. Destapar con cuidado y con un aplicador desprender el tapón de detritus todo alrededor y decantar el sobrenadante de un solo movimiento.
• En el fondo quedará el sedimento a estudiar
• Con un aplicador con algodón limpiar las paredes interiores del tubo  
• Transferir el sedimento a un porta-objetos cubrir con un cubre-objetos y examinar toda preparación con objetivo 10X. Pasar a mayores magnificaciones cuando sea necesario.
•  Para colorear quistes, agregar una gota de solución de Lugol. Descartar material utilizado en desinfectante

  

8. MÉTODO DE HARADA-MORI

PROPÓSITO:

Para estudiar la distribución regional o geográfica de las uncinarias de humanos Necator americanus y Ancylostoma duodenale;  para la diferenciación entre larvas de uncinaria y de los «huevos parecidos a los de uncinaria» (Trichostrongylus, Temidens, Strongyloides fulleborni);  en la diferenciación entre larvas de uncinaria y otras larvas, para determinar la viabilidad de los huevos y/o larvas en estudios sobre efectividad anti-helmíntica, para cultivar estadios de vida libre de Strongyloides, para embrionar huevos de tremátodos

(Paragonimus  y Fasciola)  y de cestodos (Diphyllobothrium y Spirometra), para estadios similares en parasitología veterinaria.

 Estas preparaciones pueden transportarse del campo al laboratorio, cuidando de no agitarlos, derramarlos ni permitir que se sequen

MUESTRA REQUERIDA:

 Heces frescas, sin refrigerar, recolectadas en frasco (vidrio, plástico o cartón) limpio, de boca ancha, con tapadera, debidamente identificado, sin contaminación.

VARIACIONES:

 Existen 2 variaciones: una en tubo de ensayo y otra en preparación inclinada en caja de Petri. Se describirá la original en tubo de ensayo y se mencionará lo más importante en la que utiliza caja de Petri.

Nota: Las larvas recobradas pueden ser infectantes. Aplicar medidas de seguridad: usar guantes, limpiar inmediatamente cualquier cultivo derramado con una solución de clorox, Lugol o fenol, descartar material en frascos con desinfectante.

MATERIALES:

• Tubos de ensayo de preferencia cónica, de 15 mL de capacidad, en su defecto, tubos de ensayo de 25 X 175 mm
• Tiras de papel filtro (Whatman #2 u otro similar) cortadas 2 mm menos anchas que el diámetro del tubo y 2 cm más largas, con un extremo más afinado.
•  Agua destilada, en una pipeta
•  Baja-lenguas, palos de paleta o aplicadores de madera
•  Gradilla o soporte para tubos
•  Guantes
•  Lente de aumento o lupa de mano (opcional)
•  Pipetas Pasteur
• Bulbo de goma o perilla para pipetas
• Lápiz de grafito
• Cajas de Petri de 5 cm de diámetro
• Porta-objetos
• Cubre-objetos 22 X 22 No.1 ó No.2
• Frasco con desinfectante para descartar material

PROCEDIMIENTO EN TUBO DE ENSAYO

• Con un lápiz de grafito, escribir la identificación de la muestra en el extremo más delgado de la tira de papel filtro.
• Con un aplicador o palo de paleta tomar y extender unos 0.5-1.0 g de heces sobre el tercio medio de la tira; descartar aplicador.
• Insertar esta tira con la parte escrita dentro del tubo de ensayo. Quedará una porción extendida fuera del tubo por la que pasarán elementos solubles de las heces.
• Con todo cuidado agregar agua destilada hasta que el nivel llegue por debajo del extendido de heces. Tener cuidado de no mojar las heces. 
• (Aunque no es necesario tapar los tubos, en lugares muy calientes se prefiere hacerlo para evitar la evaporación rápida del agua).
• Colocar los tubos así preparados en una gradilla y mantener en lugar seguro a temperatura ambiente.
• Revisar diariamente el nivel de agua. Remplazar aquélla perdida por evaporación, con mucho cuidado. Para verificar si hay larvas móviles en el sedimento:
• Colocarse los guantes.
• Obtener una porción del sedimento con una pipeta Pasteur, colocarlo en la caja de Petri y observar al microscopio estereoscópico.
• Para estudiar la morfología diferencial, deberá aspirar larvas con la pipeta y colocar las larvas entre porta y cubre, calentar suavemente o agregar solución de Lugol para inmovilizarlas; observar al microscopio óptico. Identificar por morfología.
• Descartar material en frasco con desinfectante. 
• Descartar guantes.

VARIACIÓN EN CAJA DE PETRI

El propósito es el mismo que el método en tubo de ensayo, excepto que aquí puede utilizar mayor cantidad de heces y puede observar el sedimento directamente al microscopio, para determinar la presencia de larvas. La identificación específica requiere observar en detalle la morfología de las larvas. Puede utilizar una caja de Petri de 9 cm, o una de 14 cm de diámetro, según cuanto material desee obtener y una tira de papel filtro del tamaño de un porta objetos de 3 X 2 pulgadas u otro soporte conveniente para heces. La identificación específica requiere observar en detalle la morfología de las larvas.

PROCEDIMIENTO:

• Extender las heces sobre la tira de papel, la que se coloca sobre el porta-objetos uso porte.
• Colocar esta preparación en la caja de Petri soportada en un extremo por aplicadores o por una varilla de vidrio para lograr una inclinación.
• Agregar agua destilada a la caja de Petri asegurando que el agua ascienda por capilaridad en la tira de papel con heces.
• Tapar y dejar a temperatura ambiente por 2-3 días. Asegurar que la preparación no se seque.
• Al cabo de 2-3 días, colocarse los guantes.
• Colocar la preparación en el microscopio estereoscópico y buscar larvas en el agua. Si no se observan,
• Con una pipeta Pasteur obtener una porción del agua de la caja y examinar entre porta y cubre en un microscopio óptico buscando larvas. O bien, verter el líquido  en un tubo de ensayo, centrifugar y recobrar las larvas del sedimento. Identificar las según características morfológicas específicas.
• Todo material se descarta en la solución desinfectante. Consultar con los diagramas provistos para identificar larvas. Para morfología diferencial,

  

9. MÉTODO DE BAERMANN

PROPOSITO

Recobrar larvas de nemátodos y en algunos casos gusanos adultos, de las heces, suelo, tejidos, etc. Es el método de elección más eficiente para recobrar larvas de infecciones por Strongyloides stercoralis. Existen 2 variaciones: una que utiliza un embudo de vidrio y otra que utiliza un vaso desedimentación o de cerveza. El principio del método es exactamente igual en ambos: recobrar larvas sedimentadas en el fondo del embudo o del vaso. Se considerará aquí el método en vaso de sedimentación

IMPORTANCIA DEL DIAGNÓSTICO

Detectar una estrongiloidiasis latente en aquellos pacientes en riesgo a quiénes se les provoca o desarrollan una inmunodeficiencia; en personas desnutridas, alcohólicas, quemadas severas, que recibirán radiaciones. Para verificación terapéutica. Se aumenta la probabilidad de diagnóstico con exámenes repetidos durante varios días o semanas.

NOTA: Es posible encontrar larvas de primer estadio de Angiostrongylus Costaricensis en heces de algunos individuos infectados. Son menos móviles que las de, Strongyloides, miden 260-290 y m de largo y poseen una muesca en la terminación de la cola, característica de larvas de Metastrongilídeos.

MUESTRA REQUERIDA:

Heces frescas, recolectadas en frasco (vidrio, plástico, cartón), limpio, de boca ancha, con tapadera, correctamente identificado. No se deben refrigerar, ya que esto inmoviliza las larvas y les impide migrar al agua.

MATERIALES:

• Vaso de sedimentación de 250 mL de capacidad
• Círculo o cuadrado de papel filtro
• Círculo o cuadrado de gasa quirúrgica en 4 dobleces
• Baja-lenguas o palos de paleta
•  Marcador
•  Pipetas Pasteur, tallo de 9 cm de largo
• Bulbo de hule para las pipetas
•  Agua corriente a 37° C
• Cajas de Petri de 5 cm de diámetro
• Porta-objetos
• Cubre-objetos de 22 X 22 mm No. 1 o No. 2
•  Frasco con desinfectante para descartar material

PROCEDIMIENTO:

• Identificar el vaso con la muestra a examinar.
• Verter el agua a 37°C dentro del vaso de sedimentación más o menos hasta 3 cm antes del borde.
• Tomar un redondel de papel filtro y con un baja-lenguas o palo de paleta, extender unos 5 g de heces frescas en capa delgada sobre éste, descartar baja-lenguas.
• Cubrir esta preparación con la gasa.
• Colocar esta preparación con la gasa hacia abajo, dentro del vaso, procurando quelas heces que den sumergidas en el agua
• Esperar una hora. Las larvas migrarán de las heces al agua y caerán al fondo del vaso.
• Después de la hora, preparar la caja de Petri identificándola. Colocar el bulbo de hule en la pipeta Pasteur. Con un aplicador de madera apartar suavemente la gasa, apretar el bulbo entre índice y pulgar e introducir la pipeta hasta el fondo del vaso. Absorber sedimento del fondo sin removerlo.
• Colocar este sedimento en la caja de Petri. Esta operación puede repetirse 2-4 veces. Examinar bajo microscopio estereoscópico, buscando larvas en el fondo de la caja.
• Para identificarlas específicamente, aspirar algunas con la pipeta Pasteur, colocarlas sobre un porta-objetos, cubrir con un cubre-objetos y buscarlas con objetivo 10Xprimero. Si están muy móviles, calentar suavemente la preparación o agregar por capilaridad una gota de solución de Lugol. Para determinar los detalles morfológicos, utilizar objetivo de 40X.
• Reconocer las características: Cápsula bucal corta, primordio genital grande. Descartar material en frasco con desinfectante.

10. MIGRACIÓN DE LARVAS EN AGAR

PROPÓSITO:

Aumentar la sensibilidad de detección por métodos no agresivos una infección por Strongyloides stercoralis. Incidentalmente podrían recobrarse larvas de Necator americanus  Y Ancylostoma duodenale  si la infección está presente.

 IMPORTANCIA DEL DIAGNÓSTICO:

Detectar una estrongíloidiasis latente en aquellos pacientes a riesgo a quienes se provoca o desarrollan una inmunodeficiencia; en personas desnutridas, alcohólicas, quemadas severas, cirróticos, que reciben radiación, etc. Estudios epidemiológicos.

VENTAJAS:

Sensibilidad de diagnóstico aumentada, adecuado en casos problema o para diagnosticar la infección en niños en quienes no puedan realizarse exámenes más agresivos (aspirado duodenal, bíopsia).

DESVENTAJAS:

Necesidad de más equipo de laboratorio, más tiempo para preparar el método, mayor tiempo de espera antes de ofrecer un resultado, menor cantidad de heces de donde se podrían extraer las larvas, necesidad de personal de laboratorio muy calificado, trabajo laborioso, impropio en lugares con una rutina voluminosa y pocos empleados poco calificados, material potencialmente infectante.

MUESTRA REQUERIDA:

Heces frescas, recolectadas en frasco (vidrio, plástico, cartón) limpio, de boca ancha, con tapadera, correctamente identificado. No se debe refrigerar la muestra, ya que esto inmoviliza las larvas.

MATERIALES:

• Cajas de Petri de vidrio o plástico, tamaño estándar (10 cm de diámetro)Cajas de Petri de 5 cm de diámetro Agar simple Extracto de res
• Peptona
• Cloruro de sodio
•  Erler-Meyer de capacidad según la cantidad de medio a preparar
• Mechero de gas
•  Bolsas plásticas
•  Baja-lenguas de madera o palos chatos de paleta o aplicadores de madera
•  Formalina al 10% en una pizeta
•  Porta objetos de 7.5 X 5.0 cm (3 X 2 pulgadas)
•  Cubre-objetos de 22 X 22 mm
•  Pipetas Pasteur tallo corto
•  Bulbo de goma o perilla
•  Incubadora (opcional) a 37°C
•  Microscopio estereoscópico
•  Microscopio óptico
•  Guantes desechables
•  Tubos de centrífuga de 13 X 100 mm
•  Centrífuga
•  Cuaderno para anotar y lápiz
•  Frascos con desinfectante para descartar material

PREPARACIÓN DEL CAMPO DE TRABAJO:

• Tener a mano y listo: Microscopio estereoscópico Pipetas Pasteur y bulbo o perilla Cajas de Petri de 5 cm de diámetro Formalina al 10% en una pipeta Tubos de ensayo de 13 X 100 mm, previamente rotulados. Solución desinfectante: clorox, solución yodada, etc. Cuaderno para anotar y lápiz

ATENCIÓN:

Material potencial mente infectante. Utilizar guantes durante todo momento de la observación de las muestras. La literatura japonesa ofrece otras ideas, pero en nuestra experiencia el uso de guantes y el tener solución desinfectante a mano es adecuado. Limpiar con desinfectante inmediatamente cualquier líquido derramado. 5enecesita determinar circunstancias de bioseguridad en la adecuación del método para estudios epidemiológicos.

PROCEDIMIENTO:

• Identificar la placa de agar con la muestra de heces a examinar.
• Con la ayuda de baja-lenguas, palo de paleta o aplicadores de madera, colocar 1 g de heces en el centro de la placa. Si las heces están duras o formadas, ablandar con unas gotas de agua destilada estéril. Tratar de que las heces queden extendidas lo más posible y en contacto con el medio de agar.
•  Tapar la placa.
• Incubar a 37°C. Pueden asimismo dejarse en un lugar protegido a temperatura ambiente, pero el tiempo de observación se prolonga.
• Incubar 24 horas.
• Antes de sacar las placas de la incubadora, ponerse los guantes. Sacar las placas y llevar a la mesa de trabajo.
• Colocar una placa en el microscopio estereoscópico y sin destapar buscar caminos de larvas y/o larvas en la superficie del medio. Si se forma agua de condensación en la tapadera, limpiar ésta con papel absorbente y descartar en desinfectante. Volver a tapar y continuar.
• Si no se observan caminos ni larvas, dejar en incubación otras 24 h. Al cabo de ese tiempo, volver a examinar en microscopio estereoscópico.
• Anotar resultados. Verter formalina al 10% sobre la superficie del agar, sin verter la sobre las heces.
• Inclinar la placa y con una pipeta Pasteur aspirar la formalina y colocar en un tubo de ensayo previamente identificado.
• Centrifugar a 1,500 rpm durante 2 minutos.- Decantar o extraer cuidadosamente el sobrenadante.
• Recobrar el sedimento con otra pipeta y colocaren un porta-objetos, cubrir y observar al microscopio óptico.
• Identificar larvas presentes por morfología específica bajo objetivo 40 X: cápsula bucal corta y primordio genital grande para larvas rabdiformes; esófago largo y punta de la cola en forma de M para larvas filariformes de S. stercoralis.

 11. MÉTODO DE COMPRESIÓN

PROPÓSITO:

Confirmar una infección por larvas en tejidos. Originalmente se diseñó para demostrar larvas de Tríchinella spiralis en músculo y diafragma sin fijación previa de cerdos en paísesdonde este parásito significaba un problema en salud. Para infecciones muy leves con esteparásito se recomienda considerar una digestión de tejidos explicada en este Manual. Algunosautores sugieren un xenodiagnóstico, en donde se alimentan ratas de laboratorio libres dela infección con el tejido sospechoso, examinándose el animal un mes después. Se describeuna modificación que se puede utilizar para estudiar ganchos rostelares de larvas de Taenia  spp. y de Echinococcus  spp.

MATERIALES:

• Porta-objetos
• Papel absorbente
• Aplicadores y alfileres entomológicos
• Microscopio estereoscópico
• Microscopio óptico

PROCEDIMIENTO:

• Dependiendo de la cantidad de tejido no fijado a examinar, utilizar un triquinoscopio (diafragma entero de cerdo) o 2 porta-objetos de 7.5 X 2.5 cm (3 X 2 pulgadas) para colocar 0.5 g o menos de tejido.
• Colocar la porción de tejido, libre de sangre y secada con papel absorbente enmedio de los dos porta-objetos y haciendo presión en los extremos.
• Comprimir el tejido.
• Observaren un microscopio estereoscópico o uno óptico para determinar la presencia de larvas de Trichinella spiralis.

CARACTERÍSTICAS:

• Si la infección es reciente, las larvas estarán no encapsuladas pero diferenciadas.
• Infecciones de meses de duración ya presentan larvas encapsuladas. La cápsula puede medir 1 mm o más, alargada, con el eje siguiendo la longitud de la fibra muscular.
• Para estudios de ganchos rostelares en larvas no fijadas de Taenia spp. y de Echinococcus spp.
• Se puede utilizar la modificación a continuación.

MATERIALES:

• Tijeras finas
•  bisturí - hoja y mango
•  Caja de Petri
•  Porta objetos de
• Plancha caliente (como se utilizan en histopatología)
•  Solución de ácido clorhídrico al 1 %
•  Alcohol etílico al 70% glicerinado al 20%
•  Medio de Berelese
•   Aplicadores de madera o alfileres entomológicos

PROCEDIMIENTO:

•  Remover con cuidado el quiste del tejido.
• Abrir el quiste con un bisturí sobre una caja de Petri de y exponer el cuello delprotoescolex.
•  Colocar éste entre 2 porta-objetos y comprimir apretando suavemente.
• Transferir de esta manera a una solución de ácido clorhídrico al 1 % para disolver loscorpúsculos calcáreos durante unos minutos.
• Sumergir en una solución de alcohol al 70% con glicerina al 20%, colocar sobre unaplancha caliente (40° - 50°C) para que el alcohol se evapore. El tejido se vuelvetransparente.
• Transferir el escolex aclarado a una gota de un medio de montaje (Berelese) sobreun porta-objetos, cubrir con un cubre-objetos y oprimir suavemente, lo que esparcelos ganchos y facilita su medición y cuenta.

12. DIGESTIÓN ARTIFICIAL

PROPÓSITO:

Recobrar larvas y adultos de helmintos o quistes tisulares de protozoos de tejidos humanos o de animales (Sarcocystis), por un proceso que utiliza un líquido parecido al jugo gástrico, el cual digiere los tejidos y deja los parásitos libres.

PARÁSITOS:

Aquí se describe el método específicamente para recobrar larvas de T. spiralis (músculo) y A.costarícensis (babosas). Pueden recobrarse otros parásitos tisulares como Onchocerca de nódulos, otras filarías, Capillaría en hígado, huevos de tremátodos en tejidos, etc ten algunos casos no se pasa el tejido por licuadora). También es un método útil para recobrar larvas de nemátodos post infección en animales de experimentación.

MUESTRA REQUERIDA:

Biopsia o tejidos (Ej: babosas, cerebro, pulmón, hígado, etc) sin fijar.

VENTAJAS:

Puede examinarse una mayor cantidad de tejido o animales enteros (pequeños roedore sp.g), con lo que se obtiene una concentración de larvas; puede recobrar quistes tisulares de protozoos y larvas o adultos que vivan en tejidos. Los parásitos se recobran vivos cuando lo están, no dañados y libres de tejidos del hospedero, lo que permite utilizar los para diversos propósitos: identificación, diagnóstico, infección experimental, preparación de antígeno, etc.

DESVENTAJAS:

No es adecuado para estadios larvados muy recientes ni para estadios calcificados, los cuales son digeridos, perdiéndose infecciones muy recientes o muy viejas.

PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN

• Líquido de digestión artificial:
• Pepsina en polvo 5 g
• Ácido clorhídrico (HCI) puro 7 mL
• Agua destilada, cantidad suficiente para 1,000 mL
• Mezclar primero el ácido clorhídrico con el agua destilada; agregar la pepsina y mezclar hasta disolución completa. Utilizar inmediatamente; si se guarda en refrigeración, puede durar pocos días solamente.

MATERIALES:

• Pinzas
• Bisturí
• Cajas de Petri
• Líquido de digestión artificial
• Gasa quirúrgica en cuadrados
• Licuadora (opcional)}
• Balanza
• Frascos de vidrio de boca ancha
• Incubadora a 37°C
• Agua destilada
• Pipetas Pasteur con bulbo o perilla de goma
• Vasos de sedimentacion
• Frascos con desinfectante para descartar material

 PROCEDIMIENTO:

• Pesar el tejido en cuestión para determinar la cantidad de líquido de digestión necesario.
• Desmenuzar el tejido o cortar en pedazos pequeños con bisturí, o introducir en la licuadora.
• Agregar el líquido de digestión artificial, 20-30 mL por cada gramo de tejido. Licuar.
• Verter en un frasco de vidrio e incubara 37°C varias horas o toda la noche, o a 45°C por 30 minutos, agitando periódicamente con una varilla de vidrio.
• Sacar de la incubadora, diluir con 2-3 volúmenes de agua destilada a 37°C y verter  esto en un vaso de sedimentación de capacidad adecuada.
• Esperar que sedimente como mínimo 1 hora.
• Para examinar el sedimento, obtener una muestra del fondo del vaso con una pipeta
• Pasteur y colocar éste en una caja de Petri, esperar un minuto.
• Examinar bajo microscopio estereoscópico. Para identificar las larvas a nivel de especie tomar algunas con una pipeta, colocar entre porta y cubre y examinar al microscopio óptico, reconociendo morfología característica.
• Si se desea recobrar todas las larvas, centrifugar todo el sedimento y recobrarlas del fondo del centrifugado.

13. MÉTODO DE LA TINTA CHINA

PROPÓSITO:

Identificar específicamente proglótidos de Taenia  expulsados por individuos infectados. No se puede enfatizar suficiente la importancia de identificar infecciones por  T. solium, por el peligro que representa para el individuo, su familia y la comunidad la diseminación de los huevos de este parásito y el riesgo de adquirir una císticercosis, tanto humana como animal. Aunque cualquier expulsión de proglótidos debe considerarse como sifueran de T. solium  mientras no se identifique la especie, es necesario identificar, registrar y tratar los casos verdaderos.

MUESTRA REQUERIDA:

Proglótidos grávidos sin fijar, colocados en un frasco tapado e identificado con el nombre, edad, sexo y procedencia del individuo. Pueden mantenerse en refrigeración por un fin de semana, pero deben llevarse al laboratorio lo más pronto posible.

VENTAJAS:

Se ofrece un diagnóstico rápido; pueden guardarse sellados e identificados parademostración y referencia.

DESVENTAJAS:

Material infectante al humano cuando es T. solium;  requiere manipulación cuidadosa,puede contaminar fácilmente el área del laboratorio. Puede no inyectarse bien elproglótido, o éste puede estar semimacerado y no revelar claramente el número de ramasuterinas necesarias para diagnóstico.

MATERIALES:

•  Jeringa y aguja de tuberculina
•  Tinta china
•  Papel absorbente
•  Agua destilada
•  Aplicadores
•  Caja de petri
•  Porta-objetos de 7.5 x 5 cm {3 x 2 pulgadas)
• Cinta adhesiva opaca- Frasco con desinfectante o agua hirviendo

PROCEDIMIENTO:

• Si el o los proglótidos están sucios con heces, colocarlos con ayuda de aplicadoresen una caja de Petri y lavar por agitación suave con agua destilada.
• Colocar un proglótido sobre 3-4 dobleces de papel absorbente y secarlo por amboslados.
• Aspirar algunas gotas de tinta china en la jeringa de tuberculina.
• Inyectar el proglótido afianzado sobre el pape! absorbente, introduciendo la agujaen la rama uterina central del proglótido como sí fuera inyección subcutánea.
• Secar con otro papel el exceso de tinta y humedad y colocar el proglótido entre 2porta-objetos.
• Ejercer presión para apretar el proglótido al mismo tiempo que otra persona sellaalrededor de la preparación con cinta adhesiva.
• Contar las ramas uterinas coloreadas con la tinta china con una lente de aumento. Número de ramas para 7.
• Cuando hay duda en situaciones de cuenta intermedia solicitar más proglótidos sinfijar o el parásito que se expulsará con tratamiento específico, recolectado directamente en una bolsa plástica o en un frasco grande limpio y seco.
• Cuando los proglótidos se reciben fijados, se colorean con carmín, que es unacoloración permanente.

14. COLORACIÓN PERMANENTE CON HEMATOXILINA

 FÉRRICA DEHEIDENHAIN

PROPÓSITO:

Método clásico para colorear e identificar estadios de protozoos comunes en hecesdel humano, sobretodo cuando sólo hay trofozoítos y las infecciones son mixtas. Lasdescripciones en los libros sobre la morfología y características de cada estadio y de cadaespecie están basadas en organismos coloreados por este método.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS:

Las ventajas y desventajas de este método van a depender de:

• Costo-efectividad
• Adiestramiento de personal.
• Es un método caro porque exige reactivos de primera clase, sobre todo el fijador y los deshidratantes (alcohol, xileno); requiere un tiempo de preparación y coloración de las muestras (mínimo 2 horas) y exige un personal de laboratorio con conocimiento sólido sobre principios celulares y morfología diferencial de los organismos. Sin embargo, para la especiación de protozoos es la más adecuada, la preparación puede guardarse para control, referencia, confirmación por terceras personas y material de estudio.

NOTA: Desde la década anterior, con la redescripción de las especies de Entamoeba histolytica y de Entamoeba dispar, la identificación por morfología de Entamoeba histolytica no es aceptada. Se prefiereutilizar métodos inmunológicos o de biología molecular. Podría hacerse una excepción en presencia de trofozoítos hematófagos recobrados de casos clínicos agudos (disentérica o amebiasis extra intestinal). Por otra parte, esta coloración en manos adiestradas ofrece la diferenciación más confiable de otras especies de protozoos patógenos y no patógenos del humano.

Hay 3 momentos claves en la ejecución de este método:

• Fijación
• Diferenciación
• Deshidratación

Al final los resultados dependerán de que se haya hecho una pronta y correcta recolección y fijación de la muestra. No se debe perder tiempo examinando una muestra mal fijada y peor teñida. Para una discusión más completa y acertada sobre el tema, consultar las referencias citadas. Para una coloración rápida (8-10 minutos) consultar la referencia de Flourno y colaboradores

15. MÉTODO ACIDO RESISTENTE MODIFICADO

PROPÓSITO:

Poner en evidencia por medio de una coloración, los ooquistes de Cryptosporídium  spp. excretados por individuos infectados. Ooquistes de otros apicomplexa como Isospora  Be //y Cydospora cayetanensis  también pueden colorearse con este método.

NOTA: Weber y colaboradores hacen notar que según su experiencia, la coloración ácido-resistente modificada (ARM) presentó en forma significativa la más baja sensibilidad diagnostica para ooquistes de Cryptosporidium spp. Ellos recomiendan una combinación de un método de concentración seguido de una coloración, sobre  todo cuando se requiere un diagnóstico epidemiológico o clínico de una infección temprana o de personas excretoras asintomáticas. Además, podría resultar muy útil durante estudios terapéuticos contra criptosporidiosis

16.MÉTODO DE CONCENTRACIÓN Y COLORACIÓN

 SEGÚN WEBER

PROPÓITO:

Proveer una mejor sensibilidad en la detección de ooquistes de Cryptosporidium  spp. en toda muestra de heces. Esta nueva técnica: 1) descarta grasas y detritus de las  heces, 2) separa los ooquistes del resto de las heces, 3) proporciona un sedimento con ooquistes concentrados, con el cual se preparan láminas para colorear y 4) permite recorrer más rápidamente las preparaciones coloreadas

VENTAJAS:

Mejora la sensibilidad del diagnóstico de criptosporidiosis, colocando el umbral de detección  de ooquistes mucho más alto, sobretodo en pacientes asintomáticos, o queinician la infección; para encuestas epidemiológicas y para confirmar efectividad terapéutica.

DESVENTAJAS:

Más tiempo de centrifugación, más número de centrifugaciones, mayor pipeteo. Requiere de acetato de etilo. Debe probarse el método primero antes de decidir sobre simplementación.

MUESTRA A EXAMINAR:

Heces formadas (las mejores) o de otra consistencia, recolectadas en un frasco deboca ancha, con tapadera, limpio y seco, debidamente identificado.

MATERIALES:

• Formalina al 10% Acetato de etilo
• Aplicadores de madera
• Umbral de detección ese! número mínimo de ooquistes que se pueden detectaren una muestra de heces, que en este método es de 5,000 por gramo.
• Pipeta Pasteur con perilla de hule o pipetas plásticas desechables
• Tubos cónicos de 15 mL de capacidad
• Solución saturada de cloruro de sodio
• Porta-objetos
• Cubre-objetos
• Agua deionizada
• Batería de coloración ácido-resistente modificad
• Balanza de dos platos para equilibrar tubos
• Frasco con desinfectante para descartar material

PROCEDIMIENTO:

• Identificar tubos y láminas con la muestra a examinar
• Suspender una pequeña cantidad de heces en formalina al 10% y emulsionar bien
• Agregar 4 mL de esta suspensión de heces, 6 mL de formalina al 10% y 3mL de acetato de etilo en el tubo cónico previamente identificado. Equilibrar
• Mezclar vigorosamente por agitación durante 30 segundo
• Centrifugar a 500 rpm durante 5 minutos
• Decantar las 3 primeras capas formadas (de arriba hacia abajo)
• Resuspender el sedimento en 5 mL de agua deionizadaVerter 5 mL de solución saturada de cloruro de sodio en otro tubo cónico
• Colocar el sedimento SOBRE la solución de cloruro de sodio por medio de una pipeta. Equilibrar
• Centrifugar a 500 rpm durante 10 minutos
• Descartar los primeros 3.5-4 mL de la capa superior líquida
• El resto del sobrenadante y unos 0.5 mL de la siguiente capa se sacan con una Pipeta y se agregan unos 13 mL de agua deionizad Equilibrar
• Centrifugara igual velocidad por 10 minutos 
• Decantar el sobrenadante
• Con alícuotas de 10 ^L del sedimento obtenido se hacen preparaciones para ver al microscopio, luego de cubrir con un cubre-objetos
• Puede observarse al microscopio y reconocer ooquistes en fresco. Sin embargo, para asegurar el diagnóstico, deberá hacer una coloración ARM u otra de su preferencia

16. MÉTODO AZUL DE METILENO-TRICROMO

PROPÓSITO:

Para el diagnóstico de microsporidia intestinales en heces de personas viviendo con SIDA y otras. La coloración se adaptó para países en desarrollo. Es más rápida sin perder eficiencia y no requiere de equipo adicional. Puede ser aplicada en laboratorios de parasitología clínica con mucho volumen de trabajo y puede facilitar el trabajo epidemiológico de microsporidiasis. Puede haber falsos negativos.

MUESTRA:

Heces frescas o fijadas

MATERIALES:

• Porta-objetos de
• Cubre objetos
• Aplicadores de madera
• Lápiz de diamante para identificar
• Frascos Coplin para coloración
• Alcohol ácido
• Etanol 95%
• Etanol 100%
• Xilol
• Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO:

• Preparar un extendido muy fino de una muestra de heces previamente fijada enformalina salina al 10% (proporción 1:3). Dejar secar.
• Fijar en metanol absoluto durante 3 minutos.
• Colorear con azul de metileno 3 minutos. Enjuagar en agua corriente.
• Colorear con tricromo por 10 minutos.
• Enjuagar en alcohol ácido 5 segundos.
• Enjuagar en etanol al 95% 1 minuto.
• Deshidratar en alcohol al 95% y al 100%, 1 minuto cada uno.
• Deshidratar en xilol o su equivalente por 10 minutos.
•  Cubrir con permount, dejar secar y examinar bajo objetivo de inmersión.

METODOS PARA PARASITOS 

TRANSMITIDOS POR VECTORES & OTROS

• 1. MÉTODO DE KNOTT

PROPÓSITO:

• Demostrar microfilarias en sangre circulante, sobre todo cuando la densidad de las mismas es muy baja. La formalina al 2% hemolisa los glóbulos rojos, facilitando la observación de las microfilarias inmóviles. Para diferenciar entre especies es necesario colorear la preparación.

MUESTRAS REQUERIDAS:

• Sangre recolectada por punción venosa y colocada en: a) un tubo con citrato como anticoagulante para analizarla después; b) directamente en un tubo con 10 mL de formalina al 2% para trabajo inmediato. Otros anticoagulantes como heparina o EDTA pueden utilizarse con Iguales resultados. Linfa y orina

MATERIALES;

• Pipetas Pasteur
• Bulbo de goma para pipetas
• Porta-objetos nuevos y limpios
• Colorante de Giemsa (para utilizar en i)
• Colorante de hematoxilina de De la field (para utilizar en ii)
• Permount
• Xilol
• Cubre-objetos 22 X 30 mm. No.1
• Tubos cónicos de centrífuga, 15 mL de capacidad, o tubos de 13 X 100 mm de fondo redondo.

 PROCEDIMIENTO:

• Rotular cada tubo con los datos más importantes de cada paciente a examinar.
• Obtener 1 mL de sangre por punción venosa, o 1 mL de la sangre con anticoagulante y mezclar en el tubo rotulado con 10 mL de formalina al 2% para iniciar hemolisis. Mezclar muy bien.
• Centrifugar a 1,500 rpm por 2 minutos.
• Decantar el sobrenadante cuidando de no revolver el sedimento en el fondo del tubo.
• Con una pipeta Pasteur tomar una muestra del sedimento, colocar una porción sobre un porta-objetos, cubrir con cubre-objetos y examinar al microscopio con objetivo 10X.
• Con la otra porción del sedimento, hacer un extendido fino en lámina previamente identificada y dejar secar completamente a temperatura ambiente.
• Colorear con (i) Giemsa para distinguir las diferentes células y poros y con (ii)hematoxilina De la field para reconocer la vaina cuando presente

2. GOTA GRUESA Y EXTENDIDO FINO




PROPÓSITO:

• Olorear estadios de Plasmodium spp. en sangre circulante de pacientes infectados, enfermos y portadores, para ofrecer un diagnóstico de laboratorio oportuno y confiable.

PRINCIPIO:

• Es posible preparar dos tipos de muestra de sangre para el diagnóstico de la malaria: el extendido fino que consiste de una sola capa de células, extendidas en un porta-objetos, y la gota gruesa que consiste de varias capas de células en una extensión menor. La identificación de los parásitos se basa en  la apariencia de los mismos, ya sea intracelulares en el eritrocito extendido fino) o libres (gota gruesa) y, más importante  en la coloración de los componentes del parásito. Una vez hecho el diagnóstico de malaria, el uso combinado de ambas muestras también permite identificar la especie de Plasmodium  y hacer un cálculo de la intensidad dela infección (parasitemia). Además, es necesario conocer los elementos formes de la sangre que se observan en los dos tipos de muestra: leucocitos polimorfonucleares y mononucleares, plaquetas y eritrocitos (extendido) o restos de eritrocitos (gota gruesa). A continuación se presentan dos coloraciones que pueden utilizarse, la de Giemsa (gota gruesa y extendido fino)y la de Wright (extendido fino).

VENTAJAS:

• La microscopía es un método sensible y específico para identificación de especies y estadios de Plasmodium. Puede además proporcionar información sobre la viabilidad delos parásitos y esto, sumado a la estimación de la parasitemia, es útil para evaluar la respuesta al tratamiento. Debido a la relativa sencillez de la técnica, es posible entrenar personal comunitario para la toma de muestras, su almacenamiento y transporte posterior para su procesamiento y lectura por personal capacitado. La gota gruesa es 20-30 veces más densa que el extendido y por lo tanto más sensible. El umbral teórico de detección de la gota gruesa es cuatro parásitos/ul de sangre (100 campos/objetivo de inmersión =0.25 ul de sangre). El extendido fino permite la especiación de Plasmodium, ya que el glóbulo rojo ha sido fijado y el parásito en su interior mantiene intactos los componentes de cada fase y características específicas.

DESVENTAJAS:

• La toma de la muestra y su procesamiento puede ser relativamente sencillo, así como la lectura de las láminas coloreadas por un microscopista capacitado, pero el factor humano hace que la calidad de la técnica sea variable. De esa manera se puede observar personal con la misma capacitación de sempeñando sus funciones con diferentes niveles de responsabilidad. Aún un microscopista. responsable y muy capacitado tiene un límite de láminas por día que puede examinar con precisión. Además, se necesita un microscopio con objetivo de inmersión, en buen estado y con buen mantenimiento. La calidad y reproducibilidad del colorante son factores críticos.

NOTA: En la actualidad están disponibles una variedad de técnicas que son más sensibles o más rápidas que la microscopía, por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa, basada en la amplificación de ADN de Plasmodium, y las pruebas rápidas a base de cintas reactivas o dipsticks, sustentadas en la captación de antigeno del parásito por anticuerpos monoclonales impregnados en una cinta de nitrocelulosa. Aunque estas técnicas no poseen las características operativas que les permita sustituir el diagnóstico microscópico, en ciertas condiciones clínicas y epidemiológicas pueden fortalecer el diagnóstico de la malaria desde el punto de vista individual o de salud pública.

MUESTRA:

Sangre periférica del dedo (pinchazo con lanceta) o sangre venosa recién tomada son las mejores muestras. También es posible usar sangre anticoagulada, pero en el caso dela gota gruesa la muestra se debe dejar secar por más tiempo (10 minutos adicionales) o intensificar el proceso de secado con calor (plancha a aproximadamente 6CPC). Se recomienda preparar en un mismo portaobjetos la gota gruesa y el extendido fino, y colorearlos simultáneamente utilizando la coloración de Giemsa

MATERIALES:

• Bloque de madera o plástico con hendiduras para secar porta-objetos
• Recipiente o plato cóncavo para colorear
• Porta-objetos limpios y libres de grasa
• Lápiz carbón
• Lanceta, algodón (o gasa) y alcohol al 70%
• Alcohol metílico puro, absoluto
• Agua destilada Botellas de vidrio, cilindros graduados, cuentas de vidrio
• Soluciones amortiguadoras
• Solución de Giemsa o bien
• Solución de Wright
• Contador manual

PROCEDIMIENTO:

• Preparación de la Gota Gruesa
• Tener todos los materiales listos. Es importante que el porta-objetos se encuentre limpio, libre de grasa que interfiera con la adhesión de la sangre al porta-objetos (o  con el deslizamiento de la misma en el caso del extendido).
• Frotar enérgicamente la yema del dedo del paciente (se prefiere el tercer dedo de la mano izquierda, talón en caso de niños pequeños o lóbulo de la oreja) con algodón humedecido con alcohol al 70%. Secar con algodón seco. El dedo se sostienen enérgicamente (importante en caso de niños) y se pincha en forma rápida. La primera gota de sangre se seca con algodón seco.
• Se utilizan dos porta-objetos. En el centro de uno de ellos se deposita la gota desangre que se obtiene por presión leve en el dedo. Sobre la superficie de trabajo y usando la esquina del segundo porta-objetos extender la sangre de manera que forme un rectángulo de grosor uniforme.4. Dejar secar la muestra y si es posible, intensificar el proceso de secado agregando calor.
• Coloración de Giemsa
• Solución de trabajo: 1 gota de solución de Giemsa por cada mililitro de solución amortiguadora o 1 mi de solución de Giemsa en 20 mi de solución amortiguadora para colorear unas 10 láminas porta-objeto (~ 2ml/lámina).
• No es posible colorear una gota gruesa con coloración de Wright.
• Colocar el porta-objetos en un recipiente de coloración o con la muestra hacia la concavidad del plato de colorear. Deslizar la solución de trabajo recién preparada por debajo del porta-objetos hasta que se llene la depresión, eliminando las burbujas. Colorear durante 8 minutos.6. El exceso de colorante se lava sumergiendo con delicadeza el porta-objetos en un recipiente con agua corriente. Sí el agua corriente no es de buena calidad, utilizar agua destilada.7. La muestra se puede secar con aire o calor moderado. Observar con aceite de inmersión.
• Preparación de un Extendido Fino
• Observar pasos 1 y 2. Después de preparar la gota gruesa, se puede realizar un extendido fino en la otra mitad del mismo porta-objetos o utilizar un porta-objetos nuevo. Cuando el extendido fino se seca, se puede utilizar su extremo grueso para identificar la muestra con un lápiz carbón o de grafito.9. Se utilizan dos porta-objetos. Al colocar la gota de sangre en uno de ellos, el borde angosto del segundo porta-objetos se coloca en un ángulo de 30 grados, se mueve hacia atrás hasta que toca la gota de sangre y entonces se desliza hacia adelante para que la sangre que está atrás se extienda. La gota de sangre debe ser pequeña de tal manera que sea total mente extendida antes de llegar al final del porta-objetos. Este extremo del extendido fino debe tener el grosor de una sola capa de eritrocitos.

Coloración de Giemsa

• Utilizar la solución de trabajo descrita arriba.
• El extendido fino seco se fija cubriéndolo con 2-3 gotas de alcohol metílico, dejándolo secar nuevamente. Cuando se prepare la gota gruesa y el extendido fino en un mismo porta-objetos, una vez que ambos ya están secos, proceder a fijar el extendido fino. Para ello, colocar el porta-objetos en posición vertical en el bloque para secar con la gota gruesa hacia arriba y el extendido hacia abajo y con ayuda de una pipeta Pasteur, verter algunas gotas de alcohol metílico puro sobre el extendido fino. Colorear la lámina en plato cóncavo Lavar el exceso de colorante. La muestra se puede secar con aire o calor moderado. Observar con aceite de inmersión.

Coloración de Wright

• No es necesario fijar con metanol el extendido fino puesto que la solución de Wright contiene suficiente cantidad de metanol para fijar y colorear la muestrasimultáneamente.15. Agregue cuantas gotas del colorante sean necesarias para cubrir la muestra. Coloree por 1-3 minutos (el tiempo óptimo de coloración variará con cada botella de colorante).16. Agregue un número igual de gotas de solución amortiguadora pH 6.8 sobre la muestra, asegurándose que el colorante y la solución de mezclan (puede ayudar soplando sobre la superficie). Colorear durante 4-8 minutos.17. Lavar agregando suavemente agua corriente con una pipeta. Dejar secar y observar con aceite de inmersión.

INTERPRETACIÓN:

•  Parásitos:
• Se deben observar tres componentes en todos los estadios, excepto en los anillos los cuales no contienen pigmento: el citoplasma azul, la cromatina rojo/morado, y los granulos amarillo-café del pigmento malárico.

OTRAS PRUEBAS DIAGNÓSTICAS 

UTILIZADAS EN MALARIA.

Se denominan Pruebas de Diagnóstico Rápido (PDR*), aquellas en donde se ha sustituido el diagnóstico microscópico por la detección de antígenos derivados de parásitos de la malaria en sangre hemolisada, utilizando métodos inmunocromato gráficos. Tienen las ventajas de ofrecer resultados en 15 minutos, no requieren de equipo especial ni de electricidad, pueden detectar  P. falciparum, aún cuando el parásito se encuentre atrapado en tejidos, facilitan el adiestramiento del personal, aún aquel voluntario, en pocas horas, son fáciles de ejecutar, la sensibilidad es uniforme y alta en presencia de infecciones con 100 parásitos 

μ L o más del 90%.

DIAGNOSTICO PARASITOLÓGICO

MÉTODO DIRECTO PARA EXAMEN MICROSCÓPICO DE

SANGRE

PROPÓSITO:

Identificar tripomastigotes de Trypanosoma cruzi  en sangre circulante durante el período agudo de la enfermedad (primeras 6-8 semanas después de la infección).

PRECAUCIÓN:

Todo personal de laboratorio que trabaja con muestras procedentes de pacientes sospechosos de tener tripanosomiasis americana o muestras de cultivos de T. cruzi  Debe tomar medidas de seguridad y buena práctica de laboratorio. Los tripomastigotes son altamente infectantes y algunas cepas del parásito son más virulentas que otras.

OPCIONES PARA EXAMEN MICROSCÓPICO DE LA SANGRE:

Se puede examinar la sangre por: gota gruesa Extendido fino Concentración de Strout Preparación de capa de leucocitos.

La ejecución de las dos últimas opciones 3 y 4 requieren tener acceso a una buena centrífuga o una micro centrífuga.

 NOTA: El examen más sencillo es el de examinar una gota de sangre en fresco del individuo sospechoso (tomada por punción capilar) entre porta y cubre o coloreada, todos los días por algunos días, parare conocer tripanosomas móviles.

• PREPARACIÓN DE CAPA DE LEUCOCITOS: WINTROBE O TUBO CAPILAR

• GOTA GRUESA Y EXTENDIDO FINO.

MUESTRA REQUERIDA:

Seguir las mismas indicaciones que para un diagnóstico de malaria, en cuanto a la preparación y coloración de la gota gruesa y extendido fino (Página 90). Una vez preparados éstos, examinar la muestra bajo objetivo de inmersión buscando tripomastigotes en forma de C o de U que miden alrededor de 21 mieras, tres veces el diámetro de un eritrocito

• MÉTODO DE STROUT:

Muestra requerida:

5 mL de sangre del paciente a investigar, recogida en tubo de ensayo sin anticoagulante.

MATERIALES:

• Batería para coloración de Giemsa. (Ver laboratorio para diagnóstico de Malaria, página88)
• Pipetas Pasteur
• Bulbo para pipetas
• Tubos de ensayo de 13 x 100 mm
• Porta objetos limpios
• Centrífuga
• Aplicadores de madera

PROCEDIMIENTO:

• Cuando se forma el coágulo, removerlo con un aplicador y centrifugar el suero apoca velocidad (1,000 rpm) por 5 minutos para separar los glóbulos rojos.
•  Con una Pipeta Pasteur, pasar el sobrenadante a un tubo de ensayo limpio.
• Centrifugar el suero a mayor velocidad (6,000 rpm) por 5-10 minutos para concentrar parásitos en el sedimento.
• Con una pipeta Pasteur remover el sobrenadante a otro tubo o descartarlo en un frasco con desinfectante y con el sedimento se puede: examinar una gota entre porta y cubre, buscando tripomastigotes activos ob) hacer extendidos en porta-objetos limpios y secos y colorearlos con Giemsa (igual método que para malaria). Una vez coloreados
• Examinar las coloraciones al microscopio con objetivo de inmersión y buscar formas de tripomastigote.

MÉTODOS PARASITOLÓGICOS MAS

 COMPLEJOS

PROPÓSITO:

Para recobrar tripomastigotes de Trypanosoma cruzi  en infección crónica durante exacerbación y período febril. Son métodos más complejos que requieren de una infraestructura especial y de personal de laboratorio altamente calificado. Se explicarán los pasos más sobresaliente de las técnicas. Consultar referencias apropiadas para más detalles en caso que se puedan implementar en el laboratorio.

•  Xenodiagnóstico
•  Hemocultivo

XENODIAGNÚSTICO:

El xenodiagnóstico es tal vez el método más sensible para diagnosticar estadios crónicos de la enfermedad de Chagas. Requiere del mantenimiento en el laboratorio de una colonia de triatomideos limpios. Recientemente la técnica utiliza 40 ninfas del vector, distribuidas en 4 cajas, las cuales se colocan en el antebrazo del paciente para que chupen sangre. Se espera un período de 30-60 días después de ésta alimentación para examinar sus heces oen el intestino disectado. Este proceso se ha modificado aun más al sembrar el intestino disectado positivo en un medio LIT con ampicilina 6.6 mg/ml, para aislar cepas de T.cruzi. El T. rangeli  existe en la hemolinfa del vector, pero a veces puede encontrarse enel contenido intestinal, por lo que se debe realizar su diferenciación.

HEMOCULTIVO:

Este método ofrece otras ventajas sobre el xenodiagnóstico:

Puede utilizarse para determinar la sensibilidad de una droga contra T. cruzi en ensayos clínicos de enfermos chagásicos.2. Es una alternativa cuando el paciente es alérgico a la picadura del vector.3. No se necesita mantener un insectario de triatomíneos. Se requieren 30 mL de sangre con heparina como anticoagulante, tomados en forma aséptica, de pacientes con serología positiva de Chagas. Se distribuyen en 6 tubos con medio LIT (Liver Infusión Tryptose), incubando a temperatura ambiente. La más alta positividad del cultivo se obtiene a los 45 días, pero el material se mantiene y examina por un período hasta de 150 días. Informar los hallazgos como positivo o negativo por T. cruzi. En lugares geográficos donde existe T. rangeli, deberá asegurarse de la identidad de la especie antes de dar el informe.

MÉTODO INDIRECTO POR SEROLOGIA

PROPOSITO:

Identificar pacientes con enfermedad crónica por T. cruzi. La aplicación de métodos indirectos requiere un laboratorio con personal calificado y una excelente infraestructura de soporte. 

DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO

PROPÓSITO:

Es un diagnóstico de certeza donde se evidencia la presencia directa del parásito en diferente material humano, según la enfermedad; ejemplo: aspirado de médula ósea para leishmaniasis visceral, raspado de úlcera para leishmaniasis cutánea. Se pueden utilizar varios métodos, como: frote, cultivo y biopsia.

FROTE (DE ÚLCERA, DE ASPIRADO, DE BIOPSIA).

VENTAJAS:

Es un método rápido, de bajo costo, alta sensibilidad y específico como un procedimiento primario. Es el método de elección para el diagnóstico confirmatorio dela leishmaniasis cutánea por la facilidad de la toma de la muestra (raspado de las lesiones cutáneas) a nivel de campo por personal de atención primaria de salud. Su análisis se hace por coloración y observación microscópica. Es también un excelente método para el diagnóstico de leishmamasís visceral.

MUESTRA:

 Raspado de las paredes de un corte de unos dos cm. paralelo a la lesión y por fuera de ella, o aspirado de los bordes indurados de la úlcera (leishmaniasis cutánea); aspirado de médula ósea o de otros órganos (hepático, ganglionar; en raras ocasiones esplénico) (leishmaniasis visceral); recobrado de pacientes o de material post-mortem.

NOTA: En leishmaniasis visceral la toma de la muestra es un método invasivo que sólo puede ser realizado por médicos, requiriendo además, equipo especial, experiencia y condiciones de nivel hospitalario. En leishmaniasis muco cutánea, el frote no es muy utilizado porque la sensibilidad diagnóstica se reduce, debido a que el número de parásitos en las lesiones mucosas es muy bajo. La toma de la muestra implica la obtención de una biopsia por un especialista

CULTIVO

PROPÓSITO:

Lograr la multiplicación de los amastigotes o promastigotes en un medio de cultivo artificial, preparado en el laboratorio, para aumentar la sensibilidad del diagnóstico de leishmaniasis.

VENTAJAS:

• Es más sensible que el frote, pues permite la multiplicación de los amastigotes de Leishmania  spp.
• Permite la caracterización del parásito aislado. Puede utilizarse en la preparación de antígeno.
• Tiene mucho valor en el diagnóstico de la leishmaniasis muco-cutánea y en laleishmaniasis visceral cuando los parásitos son escasos.

DESVENTAJAS:

• Es un método más complejo de preparar y examinar.
• Es más costoso.
• El crecimiento de los promastigotes varía mucho; algunas especies como/., braziliensis  no crecen bien o no crecen del todo.
• A veces se contamina.
• Requiere de personal de laboratorio más especializado.
• Necesita esperar varios días y hacer uno o varios pasajes a ciegas antes de ofrecer un resultado

GRADACIÓN DE LA DENSIDAD PARASITARIA DE AMASTICOTES ENFROTES DE MATERIAL ESPLÉNICO ASPIRADO

PROPÓSITO:

Aumentar la sensibilidad de la detección de (os amastigotes de Leishmania  Presentes en bazo; proporcionar una indicación de la cantidad de parásitos presente; ofrecer una medida objetiva de la velocidad de la respuesta al tratamiento y distinguir entre los pacientes de respuesta lenta y los no-respondedores.

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICOPRUEBA DE MONTENEGRO

PROPÓSITO:

Buscar marcadores producidos por la respuesta inmune del humano, inducidos por la presencia de epitoposantigénicos del parásito. Es un diagnóstico indirecto. Existen varios métodos, pero aquí se presentará la intradermo reacción de Montenegro únicamente. Se anota que hay una reacción mas no una diferencia entre referencia actual o pasada